Laporan Praktikum Biokimia “Isolasi dan Pemurnian Protein”

1. Judul Percobaan    : Isolasi dan Pemurnian Protein
   

   Hari/tanggal         : Kamis/ 19 November 2009
   

2. Tujuan Percobaan    : Mengisolasi dan memurnikan α-lactalbumin dari susu bubuk komersial
   
3. Tinjauan Pustaka
   

Pemurnian Protein

Langkah-langkah yang biasanya ditempuh untuk pemurnin protein adalah sebagai berikut (Tim Penyusun 2009).

1. Mengembangkan suatu assay untuk protein yang diinginkan
   
2. Menentukan sel atau jaringan/organ sumber protein
   
3. Mengisolasi sel atau jaringan tersebut dengan sentrifugasi
   
4. Melepaskan protein dari sumber tersebut dan melarutkannya dalam cairan buffer
   
5. Mengisolasi seluruh atau sebagian protein dengan salting out.
   
6. Memurnikan protein dengan salah satu teknik atau kombinasi teknik pemurnian seperti ion exchange adsorption, size exclusion dan affinity chromatography dan isoelectric focussing.
   

Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan teknik pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan bukan protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting out), pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organic seperti alcohol atau aseton. Namun beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan penambahan garam akan mempertinggi kelarutannya (salting in). sifat protein seperti ini dapat juga digunakan untuk pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk mempercepat pengendapan protein (Tim Penyusun, 2009).

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Holme and Peck, 1993).

Fraksinasi dengan salting out

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam dengan air (Cantarow and Schepartz, 1963).

Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya (Mayes dkk, 1990).

Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein (Yazid dan Nursanti, 2006).

Suatu campuran protein, seperti yang dapat diekstraksi dari jaringan dengan menggunakan atau larutan garam encer, dapat dipisah-pisahkan dengan penambahan sedikit demi sedikit ammonium sulfat. Pertama-tama globulin akan diendapkan dan kemudian dapat dipisahkan dengan sentrifus atau dengan penyaringan. Albumin mengendap apabila ammonium sulfat dalam larutan tersebut telah jenuh. Pemisahan dengan menggunakan garam ini, digabungkan dengan perubahan keadaan keasaman larutan dapat memisahkan campuran protein dengan cukup baik. Pemurnian selanjutnya mungkin memerlukan prosedur kromatografi yang lebih teliti (Montgomery dkk, 1993).

Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang (Mayes dkk, 1990).

Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk mempercepat dalam menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium sulfat lebih sesuai untuk pemisahan analitik dari plasma protein (Cantarow and Schepartz, 1963).

Protein Susu

Prof. Douglas Goff, seorang dairy scientist dari University of Guelph, Kanada menyatakan, komposisi susu terdiri atas air (water), lemak susu (milk fat), dan bahan kering tanpa lemak (solids nonfat). Kemudian bahan kering tanpa lemak terbagi lagi menjadi protein, laktosa, mineral, asam (sitrat, format, asetat, laktat, oksalat), enzim (peroksidase, katalase, pospate, lipase), gas (oksigen, nitrogen), dan vitamin (vitamin A, vitamin C, vitamin D, tiamin, riboflavin). Persentase atau jumlah dari masing-masing komponen tersebut sangat bervariasi karena dipengaruhi berbagai factor seperti factor bangsa (breed) dari sapi (Judarwanto, 2009).

    Protein dalam susu mencapai 3,25%. Struktur primer protein terdiri atas rantai polipeptida dari asam-asam amino yang disatukan ikatan-ikatan (peptide linkages). Beberapa protein spesifik menyusun protein susu. Protein pada bagian padat (disebut kasein) dan protein pada bagian cair (disebut whey). Kasein merupakan protein yang terbesar dalam susu dan sisanya berupa whey protein. Kadar kasein dalam susu mencapai 80% (Judarwanto, 2009).

Pemanasan, pemberian enzim proteolitik (rennin), dan pengasaman dapat memisahkan kasein dengan whey protein. Selain itu, sentrifugasi pada susu dapat pula digunakan untuk memisahkan kasein. Setelah kasein dikeluarkan, maka protein lain yang tersisa dalam protein disebut whey protein (Judarwanto, 2009).

Kasein

Casein merupakan protein yang khas dari susu. Kasein dibuat oleh kelenjar susu. Sumber utama protein susu adalah asam amino yang terdapat dalam darah (Kleiner and Orten,1962).

    Casein merupakan phosphoprotein. Casein tidak larut pada titik isoelektriknya, pH 4,6 tapi setelah pH susu mendekati 7,0, casein ada sebagai garam, Calsium Caseinate. Casein bukan protein tunggal tapi dalam bentuk grup, yang terdiri atas 3 atau lebih protein. Protein ini dinamakan α, β, κ dan λ (Kleiner and Orten,1962).

    Dalam kondisi asam (pH rendah), kasein akan mengendap karena memiliki kelarutan (solubility) rendah pada kondisi asam. Kasein asam (acid casein) sangat ideal digunakan untuk kepentingan medis, nutrisi dan produk-produk farmasi. Selain sebagai makanan, acid casein digunakan pula dalam industry pelapisan kertas (paper coating), cat pabrik tekstil, perekat dan kosmetik (Judarwanto, 2009).

Whey Protein

Whey dalam protein susu sapi memiliki persentase sekitar 20%, sedangkan sisanya merupakan casein. Walaupun jumlahnya tidak sebanyak casein, tetapi peranan whey sangat besar bagi kesehatan. Hal tersebut dimungkinkan karena whey terdiri dari fraksi-fraksi kecil protein, yang sangat vital bagi tubuh (Anonim, 2006).

Whey protein merupakan protein butiran (globular). Komponen penting yang terkandung pada fraksi whey adalah β-lactoglobulin, α-lactalbumin, imunoglobin (Ig), laktoferrin, glikomakropeptida, dan albumin serum (Anonim, 2006).

Pada suhu 64^o C albumin mulai menjadi padat, sifat ini identik dengan sifat protein pada telur. Akan tetapi karena kadar albumin yang sedikit maka pada pasteirisasi tidak dapat ditemukan, bahkan pada pemasakan yang dapat dilihat hanya merupakan titik-titik halus pada dinding dan dasar panci (Anonim, 2006).

α-lactalbumin merupakan protein penting dalam sintesis laktosa dan keberadaannya juga merupakan pokok dalam sintesis susu. Komponen imunoglobin berperan dalam meningkatkan imunitas (system kekebalan tubuh), serta anti-diare karena dapat menghambat pertumbuhan bakteri penyebab diare (Campylobacter, Shigella, Vibrio cholera, E. coli) sedangkan laktoferrin merupakan protein pengikat zat besi yang dapat membantu meningkatkan penyerapan mineral zat besi dan seng (zinc) di usus (Anonim, 2006).

Dalam whey protein terkandung pula beberapa enzim, hormone, antibody, factor pertumbuhan (growth factor), dan pembawa zat gizi (nutrient transporter). Sebagian besar whey protein tidak tercerna secara lengkap dalam usus, maka, beberapa protein utuh dapat menstimulasi reaksi kekebalan sistemik. Peristiwa ini disebut dengan alergi protein (milk protein allergy) (Judarwanto, 2009).

1. Metode Percobaan
   

Bahan dan Alat

Bahan :

1. Susu bubuk full cream komersial
   
2. Aquades
   
3. Ammonium sulfat
   
4. HCl 1,0 M
   
5. NaOH 1,0 M
   
6. Kain kasa
   

Alat :

1. Gelas piala 100 mL
   
2. pH-meter
   
3. Tabung sntrifusa
   
4. Sentrifusa
   

Isolasi dan Pemurnian α-Lactalbumin susu

1. Dimasukkan susu bubuk full cream dalam sebuah gelas piala 100 mL hingga garis batas 50 mL dan dilarutkan dengan menambahkan 50 mL air hangat (40^oC).
   
2. Ditambahkan 4 sudip ammonium sulfat perlahan-lahan sambil diaduk.
   
3. Diabiarkan selama beberapa menit sampai terjadi pengendapan.
   
4. disaring cairan tersebut dengan kain kasa.
   
5. Dituang filtrat ke dalam gelas piala 100 mL dan diukur pH-nya. Diteteskan 1,0 M HCl secara perlahan-lahan sampai pH menjadi 3,0 (± 0,1).
   
6. Cairan tersebut dipindahkan ke dalam 4 buah tabung sentrifugasi dengan volume yang sama untuk masing-masing tabung.
   
7. Disentrifugasi samapi presipitat mengendap di dasar tabung (sekitar 15 menit).
   
8. Dibuang supernatant secara perlahan-lahan
   
9. Dilarutkan kembali presipitat dalam 5 mL dan dikumpulkan ke dalam satu tabung sentrifugasi yang bersih, diukur pH-nya kemudian pH dinaikkan sampai 8,5-9,0 dengan meneteskan secara perlahan-lahan 1,0 M NaOH sambil tabung tersebut digoyang-goyangkan.
   
10. Disentrifugasi kembali cairan tersebut dan dituang dengan hati-hati "supernatant" ke dalam gelas piala
    
11. α-Lactalbumin yang relative murni terdapat di dalam supernatant di atas.
    

1. Hasil Percobaan
   

Sentrifugasi I

Filtrat	pH Awal	pH Setelah Penambahan HCl
	7,8	3,0

Sentrifugasi II

Presipitat + Air	pH Awal	pH Setelah Penambahan NaOH
	3,3	3,8

1. Pembahasan
   

Pada percobaan ini dilakukan isolasi dan pemurnian α-Lactalbumin dari susu bubuk full cream komersial. Mula-mula susu dilarutan dengan air hangat (40^oC). Jika air yang digunakan bersuhu tinggi, protein dalam susu akan terdenaturasi dan menyebabkan protein dalam susu menjadi rusak. Larutan susu selanjutnya diendapkan dengan penambahan ammonium sulfat. Protein kurang terlarut pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam dibutuhkan untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein atau dengan kata lain untuk memisahkan protein dari senyawa bukan protein yang terkandung dalam larutan susu.

Cairan kemudian disaring dengan kain kasa dan pH filtratnya diukur. pH dari filtrat adalah 7,8. Selanjutnya ditambahkan HCl 1,0 sampai pH-nya menjadi 3,0. Penambahan HCl ini ditujukan untuk memisahkan campuran protein. Protein yang terkandung dalam susu umumnya adalah casein dan whey protein..

Sentrifugasi kemudian dilakukan untuk mempercepat pemisahan protein. Setelah proses sentrifugasi ini dihasilkan dua lapisan, dimana lapisan atas merupakan casein dan sedangkan whey protein tidak larut pada pH <4 sehingga whey protein terletak pada lapisan bawah.

Setelah tahap ini, supernatant yang dihasilkan (kasein) dibuang kemudian presipitatnya (whey protein) dilarutkan kembali ke dalam air. pH setelah dilarutkan adalah 3,3. NaOH 1,0 M kemudian ditambahkan hingga pH mencapai 8,8. Penambahan NaOH ini ditujukan untuk memisahkan β-Lactoglobulin dan α-Lactalbumin yang terkandung dalam whey protein dan selanjutnya cairan tersebut disentrifugasi kembali.. Setelah disentifugasi dihasilkan dua lapisan. Pada lapisan atas (supernatant) merupakan α-Lactalbumin murni. α-Lactalbumin ini larut pada pH >6,0 sedangkan β-Lactoglobulin terdapat pada lapisan bawah.

1. Kesimpulan
   

Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bawha untuk mengisolasi dan memurnikan α-Lactalbumin dari susu bubuk komersial dapat dilakukan dengan teknik pengendapan dengan penambahan garam (salting out), penambahan asam dan penambahan basa. Sentrifugasi juga dilakukan untuk mempercepat proses pengendapan (pemisahan) protein.

1. Daftar Pustaka
   

   Anonim, 2006, Upaya Penyelamatan Whey Protein Pada Susu Segar, [http://veelabs.net/ultrajaya/ind/news_press_release_detail.cfm?NewsID=8], [20 November 2009].
   

   Cantarow and Schepartz, 1963, Biochemistry, W.B Saunders Company, Philadelphia.
   

   Kleiner and Orten, 1962, Biochemistry, The C.V. Mosby Company, St. Louis.
   

   Holme, D.J and Peck Hazel, 1993, Analytical Biochemistry Second Edition, Longman Scientific & Technical, New York.
   

   Judarwanto, 2009, Manfaat Susu Sapi, [http://childrenclinic.wordpress.com]. [20 November 2009].
   

   Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
   

   Montgomery. R. dkk, 1993, BIOKIMIA Suatu Pendekatan terorientasi Kasus, Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
   

   Yazid dan Nursanti, 2006, Penuntun Praktikum Biokimia Untuk Mahasiswa Analis, Penerbit Andi, Yogyakarta.